湿地法处理生活污水对洛阳湿地地表水微生物群
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2019-01-09 09:42

        湿地技术是20 世纪70 年代兴起的一种新型环保的生态污水处理工程技术,因管理简单、运行费用低、生态景观相容性好等优点已被成功应用于暴雨洪水、生活污水,以及富营养化水体水质净化等方面。人工湿地系统中微生物不仅是吸附和降解污染物的主要生物群体,还是评价污染物净化能力的重要指标[5]。近年来分子生物学方法得到快速发展,尤其是低成本、自动化的高通量测序技术,不仅可以同时检测样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种,还能快速准确地获得样品中的微生物群落组成,在河流[8]、湖泊水库[9]等水体细菌群落结构研究中得到广泛应用。
        目前关于湿地法处理污染物去除问题、湿地植物的选型、基质材料的开发与组合、湿地的构造等深入的研究较多,例如Zurita F[10]、Valipour A[11]、吕晓建等[12]的研究主要集中在如何提高人工湿地法污水处理效果方面,但湿地法污水处理对地表水的微生物群落影响研究较少,特别是在不影响特殊时期分洪条件下的闲置分洪道内半天然半人工湿地来处理城市生活污水,分洪道、湿地及其利用、微生物、生活污水处理、地表水这几项完全组合所开展的研究,即分洪道内的微生物在处理区域的生活污水及地表水水体的种群和数量变化几乎是空白。

洛阳市人工湿地方位图
        本课题着重于研究湿地法处理生活污水沿水流纵向(断面)水平位置地表水中微生物群落的结构和变化。利用分子生物学及高通量测序方法研究微生物多样性,从微观水平上探讨湿地地表水环境中微生物种群的变化情况,了解湿地地表水微生物种群和相对含量在不同水平面上的变化情况,从而了解湿地法运行过程中对湿地地表水微生物群落的影响,为后续工作者提供相应的理论实践支持。
        1 材料与方法
        1.1 材料
        1.1.1 样品采集
        地表水取样是从G318 国道(湿地系统入口)开始向下游的中心路处200、400、600、3 000、5 000 m,以及在湿地生活污水处理厂的上游2 000 m 的地方选取取样参考点,具体地理位置见图1。水样的采集是直接将采样器放入水面下0.10−0.30 m,收集水样1 L 储存在放入填充足够冰块的保温箱内,使运输过程中所取样品的温度保持在4 °C 以下。到达实验室后,使用微孔滤膜(0.22 μm)过滤收集微生物菌体于滤膜上,将附集有微生物菌体的滤膜放入−80 °C 保存备用。
        1.1.2 主要试剂和仪器
        Water DNA kit,美国Omiga 公司;DNA 纯化回收试剂盒,北京康为世纪生物科技有限公司;核糖核酸酶RNase A,美国Sigma 公司。PCR 仪,美国Bio-Rad 公司;超微量分光光度计,美国Quawell公司;电泳仪,北京六一仪器厂。
        1.2 方法
        1.2.1 DNA 的提取及Illumina MiSeq 测序
        采用Omiga 公司的Water DNA kit 提取水样中DNA。DNA 提取的具体步骤:用剪子将附集有微生物菌体的滤膜剪成若干小份,放入50 mL 的离心管中。加入3 mL SLX buffer 和500 mg 玻璃珠。在漩涡混合仪上混匀样品,70−90 °C (难降解的细菌)水浴10 min 在水浴过程中悬混2−3 次。加入1 mL SP2buffer 混匀30 s,冰浴5 min,然后再按照试剂盒上的步骤提取水样中DNA。DNA 的提取使用的是16SrRNA 基因V4 区的一套条形码515F 和909R 引物进行扩增, 引物序列如下: 515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′),909R (5′-CCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。

        PCR 反应体系(25μL):DNA 样品10.0 μL,1×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4.0 μL,MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL,ddH2O 补足25 μL。PCR 反应条件:94 °C 3 min;94 °C 40 s,56 °C 60 s,72 °C 60 s,30 个循环;72 °C 10 min。最后将纯化产物送至中国科学院成都生物研究所在Illumina MiSeq 平台进行高通量测序。

1.2.2 水样环境因子指标的测定


        水样理化指标的测定:地表水(CODCr)按GB 11914-1989[13]法测定,TN 按HJ 636-2012[14]法测定,TP 按GB 11893-1989[15]法测定,NH4+-N 按GB 7479-1987[16]法测定。
1.2.3 序列及统计分析测序得到的原始数据需先用Flash 软件进行双末端序列融合,然后通过添加的Barcode 将序列拆分回归到相应样品。先对序列质量进行质控和过滤,之后进行OTU 聚类分析。计算各文库的文库覆盖率、多样性指数。再用PAST 对数据进行主成分分析,用SPSS 20.0 统计软件对数据进行相关性分析的计算。高通量测序得到的原序列数据储存于NCBI,登录号为SRS3045895。
湿地系统内地表水样品的监测数据
        2 结果与分析
        2.1 地表水样品的理化指标分析
        洛阳市人工湿地污水生态处理系统位于汉江杜台分洪道内,该体系包括2 个95 m×50 m×5 m 沉淀池和2 个450 m×130 m×4 m 氧化塘,以及用中间3 m 宽道路分隔左右两端的350 m×6 000 m 生态土壤渗滤床,其中人工栽植芦苇10 万株、香蒲5 万株、水生苦草种植7.5×104 m2。生物多样性调查表明,共记录鸟类34 种,隶属10 目20 科。其中鸊鷉目、鹈形目、鹳形目、雁形目、鹤形目9 科18 种,现有鱼类13 种。自2004 年5 月投入运行以来,运行状况良好,周围生态环境也保持了原有的一定秩序,洛阳市环保部门每月定期对进出水口及受纳水体的水质进行监测,监测结果显示均可达标排放。

        本研究在湿地生活污水处理厂的上游2 000 m 的地方选取取样参考点,记为JC(−2 000 m),在前处理完后进入湿地的200 m 处设立取样点1,记为J1(200 m),以此类推设立取样点,分别记为J2(400)、J3(600)、J4(3 000)、J5(5 000 m),各点的理化指标结果如表1 所示。由表1 可见,生活污水经湿地法处理后湿地地表水COD 的范围为31.50−203.52 mg/L。J5 经湿地法处理后的COD 浓度为38.59 mg/L 达到GB 18918-2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》[17]一级标准(COD<50 mg/L);类似地,J5 经处理后TP 浓度0.15 mg/L 达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准(TP<0.5 mg/L),J5 经处理后NH4+-N 浓度0.8 mg/L 达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准[c(NH4+-N)<5 mg/L],J5 经处理后TN 浓度2.28 mg/L,达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准(TN<15 mg/L)。

2.2 地表水样品的α 多样性分析


        由表2 可知,6 个地表水样的高通量测序共获得了7 777−24 785 序列,80 524 高品质的序列(平均13 421),单个水样的OTU 数量为730.8−966.7 (平均868)。Shannon-Wiener 是反映样品中微生物多样性的指数,香农值越大,说明群落多样性越高。6 样品香农指数的平均值为8.5,J1 到J3 香农数值相差较小,说明微生物群落结构多样性相差较小。到J4 时处于较低水平,说明原始状态下的一些微生物因无法适应新的环境而逐渐被抑制、淘汰,群落多样性降低。但是到J5 处时,细菌群落多样性却出现了增长趋势,可能是水体环境达到标准后产生了某些新的微生物,因而与对照组地表水中微生物群落的多样性相似。
        类似地,Chaol 指数的平均值为2 793.5,Chao1 越大,群落种类的数量越高,最大值出现在J1,最小值出现在J5,说明200 m 微生物种类的数量高于5 000 m,可能是前期监测取样处的污染物总氮、总磷浓度太高呈现富营养化状态,因而微生物数量多,后期理化指标值降低,营养物质少造成微生物数量较少。各样本文库的覆盖率(Coverage)范围均在61%以上,基本能够代表湿地法处理生活污水中地表水细菌群落的真实情况。

        以上信息就是洛阳生活污水处理设备小编给大家提供的湿地技术对生活污水处理的研究方法。

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